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免疫細胞化學故障排除指南|Stressmarq代理商欣博盛生物

發布時間:2022-07-19   點擊次數:64次

根據下列的免疫細胞化學故障排除指南來快速找出問題原因,改善您的實驗步驟和解決方案。首先從下列選項中找到對應您免疫細胞化學染色問題的圖片:

染色較弱或沒有染色高背景染色非特異性染色
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一、染色較弱或沒有染色:


細胞從蓋玻片上脫離: 減少洗滌步驟或輕緩洗滌;用多聚賴氨酸將細胞黏合到蓋玻片上


細胞沒有被通透: 甲醇和丙酮固定能使細胞通透性增強;如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透細胞


細胞失水變干: 在整個染色過程中樣品必須保持覆蓋于液體中


細胞固定過度: 減少固定時間


一抗量不夠: 提高抗體濃度;加長孵育時間;


孵育時間太短: 增加一抗和樣品的孵育時間


切片儲存問題: 樣品處理之后應該應該馬上成像,不然信號會隨時間推移而減弱。如果需要可以將切片于 4?C 黑暗處儲存。


一抗二抗不兼容: 二抗應該是抗一抗宿主的。例如,如果一抗是小鼠來源的,那就需要用抗小鼠的二抗;亞型需要兼容


一抗不適用: 確??贵w驗證過可以用于ICC;先在免疫印跡中測試抗體, 確??贵w沒有變質


儲存問題: 反復冷凍/解凍是對抗體不利的,可引起降解. 最好是在收到產品時將其分成多個小份來保存;抗體沒有按照建議的方式保存. 如果是這樣的話可能需要重新購買一支;如果二抗沒有在黑暗處保存 (使用免疫熒光時), 應更換一支新的二抗。


蛋白沒有在檢測的組織中出現: 做一個陽性對照;如果目標蛋白顯現但是信號不強, 增加一個擴大信號步驟


二、高背景染色


抗體濃度太高: 稀釋一抗/二抗


非特異結合: 做一個沒有一抗的二抗空白對照.  如果有染色,說明二抗有非特異性結合,更換一種二抗。


阻斷不夠: 增加阻斷孵育時間或考慮更換阻斷劑。


信號放大過度: 減少信號放大孵育時間,稀釋二抗


洗滌不充分: 步驟之間的適當洗滌非常重要. 確保遵循說明說上的洗滌步驟。

 

三、非特異性染色


抗體濃度過高: 降低抗體的濃度和孵育時間


一抗產自和待測樣本來源同樣的物種 (例. 小鼠抗小鼠): 盡量使用來自不同物種的一抗.  或者阻斷內源IgG.  還可以嘗試在孵育時使用1% Triton 來清洗組織.  或用TBS-Tween 20替換 PBS-Tween 20作為洗滌液。



如有其它問題,請聯系Stressmarq一級代理商-欣博盛生物

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